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Cómo analizar los datos de un Western Blot

Escrito por christopher robison | Traducido por mar bradshaw
Cómo analizar los datos de un Western Blot

El Western blot es una técnica de electroforesis en gel que analiza el contenido proteico de un espécimen biológico.

Ryan McVay/Photodisc/Getty Images

Esta técnica es un procedimiento normal en la investigación biológica en los laboratorios y puede ser usado en diagnósticos biomédicos y forenses. El Western blot toma proteínas purificadas de una muestra de tejido y lo somete a un proceso llamado SDS PAGE, donde las proteínas son separadas por su peso usando una corriente eléctrica. Una vez que las proteínas están separadas, pueden ser transferidas a una membrana de difluoruro de polivinilo (PVDF) y analizadas en busca de varias proteínas de interés.

Nivel de dificultad:
Moderadamente difícil

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Necesitarás

  • Western blot en una membrana de PVDF
  • Solución TBST (triamortiguada salina con 0,1 por ciento de Tween-20)
  • Amortiguador bloqueante (5 por ciento potenciado con leche desnatada en TBST)
  • Mezclador
  • Anticuerpo primario
  • Anticuerpo secundario
  • Sistema de desarrollo ECL
  • Cuarto oscuro
  • Película fotográfica
  • Escáner de ordenador
  • Programa de ordenador ImageJ
  • Programa Spreadsheet

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Instrucciones

    Desarrolla un Western blot en gel para una proteína de interés

  1. 1

    Lava cuidadosamente la membrana de PVDF en solución TBST. Coloca la membrana en un contenedor rectangular lleno con TBST y ubícala en un mezclador de balanceo o de rotación a baja velocidad (80 a 90 hertz) por 10 minutos. Deshecha el TBST y repite este lavado.

  2. 2

    Lava la membrana con amortiguador bloqueante. Quita con cuidado la solución TBST y vierte una cantidad equivalente de amortiguador en el contenedor. Coloca el contenedor en el mezclado a baja velocidad por una hora.

  3. 3

    Mezcla tu anticuerpo primario mientras esperas que el amortiguador bloqueante se complete. Observa tu anticuerpo para ver qué dilución es recomendada por el fabricante y diluye en base a eso. Por ejemplo, si tu anticuerpo necesita ser mezclado en una dilución de 1:5.000, puedes medir 10 ml de amortiguador bloqueante y agregar 2 microlitros de anticuerpo primario.

  4. 4

    Vierte el amortiguador y agrega la solución del anticuerpo primario al contenedor. La cantidad de tiempo necesaria para incubar el anticuerpo primario con la membrana de PVDF variará con el anticuerpo y la muestra de tejido. El procedimiento más común es colocar la membrana en un mezclador a velocidad baja y a 4 grados Celsius (en un refrigerador) por 16 a 18 horas. Tu anticuerpo debería traer indicaciones sobre el tiempo de incubación.

  5. 5

    Enjuaga la membrana de PVDF. Quita la solución de anticuerpo primario y enjuaga la membrana por 10 minutos en TBST a temperatura ambiente. Repite este lavado dos o tres veces.

  6. 6

    Incuba la membrana con el anticuerpo secundario. Tu anticuerpo secundario viene con la dilución recomendada. Por ejemplo, si la dilución recomendada es 1:10.000, puedes agregar 1 microlitro a 10 ml de amortiguador bloqueante. Asegúrate de que tu anticuerpo secundario esté etiquetado como "HRP-conjugado" ya que otros anticuerpos pueden no funcionar apropiadamente en equipos ECL.

  7. 7

    Desarrolla la membrana de PVDF usando ECL o un sistema comparable de quimioluminiscencia. Verifica las indicaciones que vienen con tu equipo ECL para ver cómo mezclar la solución en desarrollo y cómo desarrollar apropiadamente la membrana.

    Desarrollo de la membrana PVDF

  1. 1

    Expone una película fotográfica a la membrana. Dentro de los 10 a 15 minutos de desarrollo de ECL, lleva la membrana de PVDF a un cuarto oscuro. En oscuridad completa expone una película fotográfica en blanco a la membrana y colócala en la máquina de revelado del cuarto oscuro.

  2. 2

    Una vez que la película sale del revelador, enciende las luces y verifica si la película está adecuadamente desarrollada. Si la película está demasiado clara, deberás exponer la membrana a otra película por más tiempo. Si la película está demasiado oscura, puedes intentar exponer otra película por un minuto o 30 segundos.

  3. 3

    Registra el tiempo de exposición que ha creado una película bien desarrollada. Puedes usar este tiempo para todas las corridas subsecuentes de este procedimiento.

  4. 4

    Escanea la película desarrollada para introducirla en un ordenador. Con la mayoría de los escáneres puedes colocar la película sobre el cristal y pulsar el botón. Consulta las instrucciones que acompañan a tu escáner para determinar si este es el procedimiento correcto. Una vez que la película haya sido escaneada, guarda la imagen con un título descriptivo que seas capaz de recordar luego.

  5. 5

    Abre la imagen guardada en el programa ImageJ. ImageJ ha sido desarrollado por el National Institutes of Health (NIH) y está disponible gratuitamente en línea.

    Compara las bandas sobre las películas desarrolladas

  1. 1

    Obtén una medición de fondo. Realiza una selección rectangular alrededor de la banda más grande en el Western blot usando la herramienta de selección (el primer icono en la barra de herramientas). Luego mueve el rectángulo a un área no desarrollada y vacía de la película. Presiona Control+M para medir la oscuridad de fondo.

  2. 2

    Mueve el rectángulo a la primera banda en la película y presiona Control+M nuevamente. Repite esta secuencia para todas las bandas de la película que deseas analizar.

  3. 3

    Copia los datos de la banda. Cuando comienzas a medir, una ventana de "resultados" aparecerá. Una vez que termines las mediciones, resalta todos los datos de medición y presiona Control+C para copiarlos. Abre tu programa de Hoja de Cálculos y presiona Control+V para pasar los datos de medida. Con cuidado etiqueta todos los datos pasados y guarda la información cuando hayas terminado de medir todas las películas.

  4. 4

    Determina la densidad de cada banda. El valor para tus mediciones de fondo debe ser el número más alto ya que es más brillante que las bandas opacas de tu película de Western blot. Resta los valores de medición de bandas de los valores de fondo para determinar la densidad relativa. Por ejemplo, si tu valor de fondo es 200 y tienes cuatro bandas con valores de brillo de 150, 170, 180 y 190, los valores finales para esas cuatro bandas son 50, 30, 20 y 10.

  5. 5

    Compara los grupos experimentales usando cualquier análisis estadístico que desees emplear. La mayoría de los experimentos usan una técnica llamada ANOVA (análisis de variación) para comparar valores entre grupos. Muchos paquetes estadísticos como PSAW han incorporado procedimientos estadísticos para ejecutar ANOVAs sobre datos con el formato correcto.

Consejos y advertencias

  • Mezcla tu amortiguador bloqueante inmediatamente antes de comenzar los lavados. El amortiguador puede contaminarse fácilmente y sólo se mantiene fresco por algunos días.
  • Siempre verifica la hoja datos de seguridad del material para determinar los correctos procedimientos de seguridad al manipular químicos.
  • Nunca expongas una película no revelada a la luz. Esta dañará la película.

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