Cómo analizar una electroforesis

Escrito por john brennan | Traducido por erick velasquez centellas
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Cómo analizar una electroforesis
(Jupiterimages/Comstock/Getty Images)

En la electroforesis en gel, se separan las muestras de ADN o proteínas (basándose típicamente en el tamaño) mediante la aplicación de un campo eléctrico que hace que migren a través de un gel. El uso de la electroforesis en gel es una rutina en los laboratorios de investigación biomédica y se utiliza para responder a una variedad de preguntas diferentes, por lo que en realidad no hay una forma universal para analizar los resultados. Las diferentes técnicas como Western Blot, Northern y Southern Blot, por ejemplo, implican electroforesis en gel. Si estás haciendo la electroforesis en gel de agarosa para muestras de ADN, el procedimiento más común por lo general tendrá que hacer por lo menos dos cosas: 1) distinguir los plásmidos sin cortar a partir de inserciones, plásmidos muescas y plásmidos cortados y 2) estimar el tamaño de los diversos fragmentos de ADN. Así es como funciona.

Nivel de dificultad:
Moderadamente difícil

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Necesitarás

  • Imagen del gel (tomada con luz ultravioleta, lo que hace que las bandas teñidas con bromuro de etidio sean visibles)
  • Excel u otro programa de graficación
  • Regla

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Instrucciones

  1. 1

    Revisa tu cuaderno de apuntes del laboratorio para determinar qué muestras se cargaron en qué carriles. Cuando se cargan los pozos para el gel, se debería haber tomado nota de la identidad de cada carril / muestra.

  2. 2

    Determina qué carril contiene la "escalera" estándar de ADN. Estos son fragmentos de longitud conocida, su distancia de migración se puede utilizar para determinar el tamaño de los fragmentos de muestra.

  3. 3

    Utilizando una regla, mide la distancia en la imagen de los pocillos hasta el colorante de rastreo, que habrá recorrido más allá de cualquiera de las bandas de ADN (en otras palabras, será en la parte inferior del gel). Anota este número; las unidades que utilices no son importantes.

  4. 4

    Mide la distancia de los pozos en la imagen de cada una de las bandas de la "escalera" y luego divide esa distancia por la distancia recorrida por la banda del colorante de seguimiento. Este cálculo da como resultado la movilidad relativa de cada banda. Ejemplo: Supongamos que la banda viajó 6 pulgadas por el tinte de seguimiento y tenemos tres bandas que viajaban cinco, 4.5 y 3.5 pulgadas. ¿Cuál es su movilidad relativa? Respuesta: Nosotros dividimos 5, 4,5 y 3,5 por 6 para obtener movilidades relativas de 0,833, 0,75 y 0,5833.

  5. 5

    Introduce las movilidades relativas a tu programa de cálculo (Excel o cualquier otro programa similar que utilices), junto con el tamaño en kilobases de cada fragmento de la escalera. (El fabricante proporciona el tamaño de cada fragmento en las escaleras que suministra, por lo que ya debes tener esta información).

  6. 6

    Haz el gráfico de los datos con la movilidad relativa en el eje X y el tamaño en kilobases en el eje Y.

  7. 7

    Utiliza la función de línea de tendencia en tu hoja de cálculo para adaptar la ecuación a los datos. Esta ecuación debe ser una ecuación de energía (por ejemplo, x ^ -2) y debe ajustarse relativamente bien a los datos (R-coeficiente de al menos 0,9)

  8. 8

    Revisa las bandas correspondientes a las muestras. Recuerda que los pequeños fragmentos de ADN que viajan más lejos a través del gel (de grandes fragmentos), por lo que los más cercanos a la tintura de seguimiento serán los más pequeños. Nota, sin embargo, que si el plásmido (circular) de ADN es cortado, se convertirá en "superenrollado" o retorcido como un cable telefónico, que en realidad hará que viaje más lejos (FARTHER) que el ADN lineal del mismo tamaño. Del mismo modo, las "muescas" de plásmido que se ha cortado incompletas viajarán una distancia menor (SHORTER) que el ADN lineal del mismo tamaño. En consecuencia, no se puede estimar el tamaño de los plásmidos de tu gel sin cortar.

  9. 9

    Alinea las bandas en cada carril con la identidad de la muestra que se ha cargado en ese carril y determina si lo que ves es lo que hubieras esperado. Esto dependerá de la naturaleza de tu experimento. En general, sin embargo, si se digiere una inserción de plásmido con dos enzimas de restricción, se esperaría que el inserto se libere a partir del plásmido, ya que es mucho más pequeño que el plásmido; puedes esperar para ver a dos bandas en ese carril, uno cerca de la parte superior y el otro hacia abajo, cerca del fondo. Un plásmido cortado con la enzima de restricción debe formar solamente una única banda que se desplaza un poco más allá del plásmido cortado con dos enzimas de restricción, pero no tan lejos como el inserto.

  10. 10

    Mide la distancia desde los pozos al plásmido cortado e inserta bandas con tu regla. Divide esos números por la distancia recorrida por el colorante de rastreo, para encontrar la movilidad relativa de las inserciones y los plásmidos cortados.

  11. 11

    Conecta la movilidad relativa de las inserciones y corta los plásmidos en la ecuación de tu programa de hoja de cálculo que fue calculado para ti. Este cálculo debe darte una estimación del tamaño de estos plásmidos.

Consejos y advertencias

  • Si ves las bandas brillantes y anchas en la parte inferior de cada carril (es probable que tengas algunos de ARNs en el gel) el protocolo de purificación puede ser erróneo.

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