Cómo calcular la concentración ARN

Escrito por anne mullenniex Google | Traducido por joaquín di toma
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Cómo calcular la concentración ARN
Tendrás que multiplicar la absorbancia, el factor de dilución y 40μg/ml para obtener la concentración. (Calculator image by Alhazm Salemi from Fotolia.com)

Cuantifica tu muestra de ARN mediante la medición de su absorbancia de la luz ultravioleta (UV). Un espectrofotómetro de nano-gota utilizará sólo uno o dos microlitros de la muestra, que podrás recuperar. Otros espectrofotómetros requieren una muestra mucho mayor. El coeficiente de extinción de los nucleótidos en una longitud de onda UV de 260 nm en una trayectoria de la luz 1 cm es de 20. En base a este coeficiente de extinción, la absorbancia de 40μg/ml de ARN en las mismas condiciones es uno. Con esta información, puedes calcular la concentración de la muestra de ARN.

Nivel de dificultad:
Moderado

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Necesitarás

  • Espectrofotómetro
  • Calculadora

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Instrucciones

  1. 1

    Diluye la muestra, de ser necesario. Una dilución estándar para una microcubeta es 1:40. Haz esta dilución añadiendo 2μL de muestra de ARN a 78μL de agua estéril.

  2. 2

    Sigue los protocolos de tu espectrofotómetro particular, para calibrar la máquina mediante el uso de un espacio en blanco y luego determinar la densidad óptica de la muestra en una longitud de onda UV de 260 nm.

  3. 3

    Multiplica la absorbancia de la muestra por el factor de dilución por 40μg de ARN/ml. La ecuación sería: "la concentración de ARN (µg/ml) = (DO260) x (factor de dilución) x (40μg de ARN/ml) / (1 unidad de DO260)" (Hofstra.edu) Por ejemplo: Si se diluyes la muestra por 1:40 y tu lectura de la absorbancia fue de 0,08, tendrías que multiplicar 0,08 x 40 x 40 = 128 µg/ml = 0,13 µg/μl

  4. 4

    Calcula la pureza de la muestra tomando alguna otra lectura de absorbancia a 280 nm de longitud de onda UV. El cociente de OD 260 / OD 280 indicará si, y en qué nivel, la muestra está contaminada con proteínas o fenol. Un resultado de 1,8 a 2,0 indica la calidad del ARN.

Consejos y advertencias

  • No olvides calibrar el espectrofotómetro.
  • Correr un gel de electroforesis rápido confirmará los resultados de tus especificaciones.
  • No asumas que tu muestra es pura. Tomarse el tiempo necesario para una relación OD260/OD280 ahorra tiempo y dinero.

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