Cómo hacer una calibración estándar para un HPLC

Escrito por michael judge | Traducido por mayra cabrera
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Cómo hacer una calibración estándar para un HPLC
La calibración de un HPLC con frecuencia requiere de una serie de diluciones. (Jupiterimages/Comstock/Getty Images)

Cuando se trabaja con cromatografía líquida de alta resolución (HPLC), una buena calibración es absolutamente esencial para garantizar resultados fiables y de calidad. La calibración apropiada de un HPLC comienza con la realización de un patrón de calibración adecuado. En la mayoría de los casos, la calibración de hecho requiere una serie de patrones de concentración cada vez mayor con el fin de producir lo que se conoce como una curva de calibración. Esta es una línea trazada y una ecuación asociada que describe la relación entre la concentración de la sustancia a ser probada y la respuesta del detector de HPLC.

Nivel de dificultad:
Moderado

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Necesitarás

  • Material de analito patrón trazable
  • Matraces volumétricos
  • Pipetas
  • Báscula analítica
  • Calculadora
  • Solvente

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Instrucciones

    Instrucciones para calibrar un HPLC

  1. 1

    Determina el químico que deseas probar para utilizar el HPLC (el "analito"). Por ejemplo, es posible que desees probar una serie de refrescos para conocer el contenido de fructosa, en cuyo caso la fructosa sería el analito.

  2. 2

    Obtén una cantidad del analito químico de pureza adecuada. Normalmente la pureza debe estar por encima del 99% y el analito deberá ser comprado en una compañía de suministro de productos químicos de renombre. En el caso de la fructosa, por ejemplo, tendrías que comprar fructosa pura de un proveedor de productos químicos y no en una tienda de comestibles.

  3. 3

    Determina las concentraciones máximas y mínimas esperadas del analito en las muestras que vayas a probar en el HPLC. En el caso de las bebidas sin alcohol, debes examinar las etiquetas de las bebidas y determinar el contenido de fructosa de menor a mayor entre las bebidas que ensayarás. Ten en cuenta que la muestra inicial (la bebida) se puede diluir o manipular de otra manera durante la preparación para el análisis (dependiendo del método de HPLC utilizado) y por tanto la concentración de analito en las muestras inyectada en el HPLC puede ser modificada. Esta es la concentración de analito en las muestras que se corre en el HPLC que debe ser considerada.

  4. 4

    Determina el disolvente en el que disolverás el analito para hacer patrones de calibración. Este disolvente debe ser capaz de disolver adecuadamente el analito dentro de una gama relativamente amplia de concentración (por lo menos tan alta como en las muestras que deseas probar). Además, este solvente idealmente debería ser muy similar a la "fase móvil", el solvente utilizado para acarrear las muestras a través de un HPLC.

  5. 5

    Calcula la cantidad de analito requerido para hacer una "solución patrón" del analito. Esta se encuentra multiplicando la concentración requerida de la solución patrón por el volumen deseado. La concentración del analito en esta solución debe ser por lo menos 10% mayor que la concentración más alta de la muestra prevista. Si la concentración más alta de fructosa prevista en una bebida sin alcohol es 8 g/100 mililitros, entonces la solución patrón se podría hacer a una concentración de 10 gramos fructosa/100 mililitros. Un volumen razonable es 500 mililitros, así 8/100mL x 500 mL = 40 gramos de fructosa serían necesarios.

  6. 6

    Pesa la cantidad necesaria de analito de manera precisa. A menudo, un valor de peso en gramos preciso para una o dos cifras decimales es adecuado, pero más precisión puede ser necesaria para algunos métodos.

  7. 7

    Transfiere el analito pesado en un matraz aforado al volumen necesario y añade el solvente deseado hasta la marca del matraz. Utilizar un matraz volumétrico (en lugar de un vaso de precipitados graduado, por ejemplo) aumenta la precisión del valor de la concentración de la solución patrón. Asegúrate de que todo el analito se transfiere al matraz; utiliza parte del disolvente para lavarlo, si es necesario.

  8. 8

    Tapa el matraz y agitar suavemente o invierte hasta que el analito esté completamente disuelto.

  9. 9

    Haz una serie de diferentes diluciones de la solución patrón transfiriendo volúmenes conocidos de la solución patrón en matraces volumétricos, utilizando pipetas para una transferencia precisa, luego añade el disolvente. La concentración más baja estándar debe estar por debajo de la muestra más baja de la muestra prevista para ser analizada. En el ejemplo de la bebida sin alcohol, si la concentración más baja prevista de fructosa en una muestra es de 2 gramos/100mL, entonces un estándar de 1 gramo/100mL se podría hacer. Esto se haría mediante una dilución de diez veces la solución patrón. La serie estándar debe incluir un total de 5 o 6 concentraciones, por lo que diluciones adicionales para producir estándares de quizás 3, 5 y 8 gramos de fructosa/mL serían necesarias. Ahora tienes una serie de soluciones estándar con las que puedes calibrar el HPLC.

Consejos y advertencias

  • Es posible hacer las calibraciones estándar que contengan más de un analito, si es requerido.
  • Es una opción filtrar las muestras de calibración (y soluciones patrón) antes de inyectarlas en el HPLC para eliminar cualquier partícula fina que pudiera tapar el instrumento.
  • Algunos estándares se degradan fácilmente después de preparase. Asegúrate de que tus estándares son cambiados con frecuencia, si es el caso.
  • Como con todos los procedimientos químicos, mantén las precauciones adecuadas cuando trabajes con analitos o solventes potencialmente peligrosos como aquellos que son tóxicos o inflamables.

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