Cómo diseñar un primer para PCR

Escrito por sarah quinlan | Traducido por mariano salgueiro
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Cómo diseñar un primer para PCR
Los primers son necesarios para amplificar regiones de ADN. (Photodisc/Digital Vision/Getty Images)

De acuerdo con el sitio web BioWeb de la Universidad de Wisconsin, un primer para PCR es un oligonucleótido corto y sintético (suele tener entre 18 y 25 pares de bases), usado para amplificar regiones específicas de ADN en una técnica de biología molecular conocida como reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Se necesita un primer forward (hacia adelante) y un primer reverse (se denominan así puesto que avanzan en sentidos opuestos), diseñados de tal manera que sean complementarios a la hebra de ADN, y que se unan a la región de ADN deseada. Cuando los científicos quieren hacer una investigación sobre un gen específico o región de ADN, primero tienen que hacer una PCR para adquirir una cantidad suficiente de la región objetivo con la cual trabajar. Diseñar secuencias primer para la región de interés puede ser necesario en caso de que todavía no estén disponibles comercialmente o debido a investigaciones anteriores publicadas.

Nivel de dificultad:
Difícil

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Necesitarás

  • Una secuencia de nucleótidos de la región objetivo de ADN
  • Un programa o sitio web de diseño de primers

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Instrucciones

  1. 1

    Consigue la secuencia de nucleótidos del gen o de la región de ADN de interés, y decide qué tan largo será el fragmento que deseas amplificar. Los primers forward y reverse se diseñan de tal manera que se unan al principio y al final del fragmento deseado. Típicamente, los métodos de PCR convencionales usan primers que flanquean una región que tiene de 100 a 1.000 pares de bases, mientras que los métodos de PCR en tiempo real usan fragmentos que tienen de 50 a 200 pares de bases.

  2. 2

    Decide en qué parte de la secuencia quieres que se unan los primers. Por ejemplo, tal vez quieras que la ubicacion esté cerca del extremo 5' ó del 3' de la secuencia, o tal vez quieras que sea en el medio. Si lo deseas, diseña la ubicación de los primers para abarcar un intrón.

  3. 3

    Sigue las instrucciones recomendadas para diseñar los primers. La amplificación exitosa de productos de ADN depende de la calidad de los primers, y ciertas variables son críticas.

  4. 4

    Diseña primers que tengan entre 18 y 24 pares de bases de largo. Vincent R. Prezioso, Ph.D., de Brinkmann Instruments Inc., sugiere que esta longitud es lo suficientemente larga como para ser extremadamente específica a la región de ADN deseada, pero lo suficientemente corta como para unirse (temple) con facilidad. La temperatura de fusión de los primers (Tm) debería ser de entre 55 y 80 °C, lo suficientemente baja como para que se complete la fusión, pero lo suficientemente alta como para permitir que ocurra el recocido. El contenido de GC (porcentaje de Gs y Cs en la secuencia) debería ser de 40-60%. El extremo 3' de la secuencia del primer debería terminar en una C o una G (esto se denomina abrazadera GC) para promover la unión, ya que los nucleótidos G y C tienen uniones más fuertes, sin embargo, evita tener tres o más Gs o Cs en las últimas cinco bases de la secuencia.

  5. 5

    Evita tener series de cuatro o más repeticiones de nucleótidos (como ACCCC...) o cuatro o más repeticiones de di-nucleótidos (como ATATATAT...) ya que pueden ocasionar errores en la técnica. Diseña primers sin homología intra-primer (más de tres bases que se complementen dentro del mismo primer) u homología inter-primer (esto ocurre cuando los primers forward y reverse tienen secuencias complementarias). Esto puede generar auto-dímeros o dímeros entre primers, donde los primers se unen a sí mismos en vez de unirse a la secuencia de ADN deseada.

  6. 6

    Usa recursos en línea y sitios web que te ayuden a diseñar primers o que te ayuden a verificar las secuencias de primers en busca de auto-complementaridad o potencial para generar estructuras secundarias, como horquillas. Algunos sitios web de diseño de primers incluyen al Primer3 del Instituto Tecnológico de Massachusetts, el Primer-Blast del Centro Nacional de Información Biotecnológica y el OligoAnalizador de Tecnologías Integradas del ADN.

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