Cómo identificar un carbohidrato con reactivo de Bradford

Escrito por tricia lobo | Traducido por maximiliano magnano
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Las coloraciones permiten identificar cantidades y tipos de carbohidratos en una solución. El reactivo de Bradford, usualmente, se utiliza sólo para contar la cantidad de proteínas en una solución. Sin embargo, hay dos casos específicos en los que podrías usar el reactivo de Bradford para identificar carbohidratos: cuando están bajo la forma de glucoproteínas (en otras palabras, azúcares unidos a proteínas) y cuando sabes que tu solución consiste solamente de carbohidratos o de proteínas, y quieres confirmar que no tenga proteínas.

Nivel de dificultad:
Difícil

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Necesitarás

  • Placas de ensayo
  • Espectrofotómetro
  • Paquete de coloración Bradford
  • Materiales estándar para manejar líquidos de laboratorio

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Instrucciones

    Cuantificar glucoproteínas

  1. 1

    Calienta el espectrofotómetro dejándolo encendido durante por lo menos 15 minutos antes de comenzar a usarlo.

  2. 2

    Prepara pequeñas muestras que tengan concentraciones conocidas de glucoproteínas o "estándares conocidos". Comienza tus concentraciones con tanto como 100 microgramos de glucoproteínas por mililitro de agua destilada, y por cada estándar subsiguiente, diluye tu concentración a la mitad, es decir, 50 microgramos por mililitro, 25 microgramos por mililitro.

  3. 3

    Agrega tintura reactiva de Bradford y Azul brillante G de tu paquete de ensayo de Bradford a cada estándar conocido. Déjalo reaccionar por cinco minutos.

  4. 4

    Prepara la muestra para la que quieras cuantificar tu concentración de glucoproteínas. La muestra debería contener entre cinco y 100 microgramos de glucoproteína por mililitro. Agrega tintura reactiva de Bradford y azul brillante G.

  5. 5

    Coloca la placa de ensayo que contiene los estándares y los desconocidos en un espectrofotómetro. Para los estándares, obtén una curva de calibración, graficando la absorbencia contra la concentración conocida. Esta curva, por el registro de concentraciones utilizadas como se mencionó antes, debería ser lineal. Calcula una ecuación lineal para describir tu curva.

  6. 6

    Conecta los valores de absorbencia para tu muestra conocida a la ecuación lineal que conseguiste en el paso anterior. Calcula la concentración de glucoproteína para tu muestra.

    Usar reactivo de Bradford para confirmar la cantidad de carbohidratos de una solución

  1. 1

    Agrega tintura de Bradford y Azul brillante G a la muestra desconocida en la placa de ensayo.

  2. 2

    Agrega tintura de Bradford y Azul brillante G en otro hueco de la placa de ensayo, sin agregar ninguna solución conocida o desconocida.

  3. 3

    Lee la placa de ensayo en el espectrofotómetro, a 465 y 595 nm. El hueco que contenga solamente tintura de Bradford y azul brillante G debería tener una absorbencia tope (el largo de onda en el que la absorbencia está al máximo; el software de tu espectrofotómetro mostrará este resultado automáticamente) de 465.

    Para la muestra desconocida, si contiene proteínas, el máximo de absorbencia ocurrirá a los 595 nm. Por otro lado, si tu muestra tiene principalmente carbohidratos en lugar de proteínas, como el hueco que contiene solamente tintura de Bradford y Azul brillante G, el máximo de absorbencia ocurrirá a los 465 nm.

Consejos y advertencias

  • Si tu muestra contiene detergentes, el ensayo de Bradford no funcionará.
  • Los detergentes se unirán a la tintura de Bradford, causando un incremento en la absorbencia a 595 nm independientemente de la presencia de proteínas y conduciéndote a resultados incorrectos.

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