Principios básicos del Western Blot

Escrito por mike evans | Traducido por mayra cabrera
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Principios básicos del Western Blot
La técnica de Western blot se utiliza para la detección e identificación de proteínas unidas a un anticuerpo específico. (Kim Steele/Photodisc/Getty Images)

El Western blot, también conocido como inmunotransferencia, es una técnica utilizada en la biología para detectar ciertas proteínas en una mezcla compleja de diferentes proteínas. La técnica alcanza su objetivo mediante el uso de un anticuerpo policlonal o monoclonal que es específico para esa proteína en particular. La técnica consiste en tres etapas: bloqueo de la membrana, la aplicación del primer anticuerpo, la aplicación del segundo anticuerpo y la detección.

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Bloqueo de la membrana

En esta etapa, la membrana celular se bloquea. El propósito de hacer esto es reducir el número de interacciones de proteínas no específicas entre la membrana y el anticuerpo. Esto limita el número de proteínas que podrían ser la proteína diana. Esto se realiza mediante la colocación de la membrana celular en una solución de albúmina de suero bovino o leche desgrasada en polvo.

Primer anticuerpo

En esta etapa, el primer anticuerpo que es específico para la proteína diana es colocado en incubación en la membrana celular. Una solución tampón que contiene una proteína portadora y detergente se utiliza para diluir el anticuerpo. Mientras las concentraciones de estos elementos son correctas, el primer anticuerpo no debe unirse a ninguna de las proteínas no-objetivo en la membrana celular sino sólo a la proteína diana.

Segundo anticuerpo

En esta etapa, la membrana se lava para eliminar cualquier anticuerpo remanente no unido de la primera, dejando sólo el primer anticuerpo unido. Después de esto, un segundo anticuerpo se incuba en la membrana. Este segundo anticuerpo se une al primer anticuerpo. El segundo anticuerpo se asocia generalmente con una enzima que produce fluorescencia, la cual permite a los científicos identificar visualmente el anticuerpo. A falta de ello, se puede utilizar un marcador radiactivo para facilitar la identificación.

Detección

Aquí, los anticuerpos secundarios no unidos se lavan, dejando sólo el primer anticuerpo unido y el segundo anticuerpo unido. El sustrato de la enzima se incuba a continuación en la membrana. Esto hace que las posiciones de la unión del segundo anticuerpo emitan luz visible. La observación encontrará que las regiones más oscuras de la película detectada corresponden a la proteína de interés. Las densidades de las diversas bandas de luz proporcionan más información sobre la abundancia relativa de la proteína de interés en comparación con los otros elementos de la solución.

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