Problemas con la electroforesis en gel

Escrito por palmer owyoung | Traducido por mar bradshaw
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Problemas con la electroforesis en gel
La electroforesis en gel se usa para separar hebras de ADN de diferente tamaño, ARN y proteínas. (DNA vaccine image by erbephoto from Fotolia.com)

La electroforesis en gel es un método fundamental usado en las investigaciones de biología molecular para separar hebras de ADN de diferente tamaño, ARN y proteínas. Consiste en la preparación de un gel a partir de materiales como poliacrilamida o agarosa, preparar la muestra con una tintura y luego sembrar la muestra en el gel. Existe un gradiente de tamaño en el gel, de manera que las moléculas más grandes permanecen en un extremo, mientras que las más pequeñas corren hacia el otro extremo del gel. Aunque es una técnica simple, los problemas son extremadamente frecuentes debido a la biología de la muestra o a los factores electroquímicos.

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Un gel "en blanco"

Los geles en blanco no muestran absolutamente ningún signo detectable de la muestra. Si la escala o marcador de ADN que fue cargado en el gel y corrido junto con la muestra es detectable, entonces es posible que la muestra no haya sido mezclada con el colorante. Si no es visible, la muestra puede haber sido corrida fuera del extremo del gel.

Una banda esperada no aparece

Verifica que el porcentaje de agarosa usado para preparar el gel sea el correcto; cantidades más altas son usadas para ácidos nucleicos más pequeños o masa proteica, mientras que las cantidades más grandes se usan para masas más altas. La cantidad errónea de agarosa puede hacer que los ácidos nucleicos pequeños o las proteínas se derramen o corran fuera del gel. También debes verificar que se aplique la cantidad correcta de muestra sobre el gel y que el ADN no haya sido degradado por nucleasas.

Bandas manchadas

Una señal manchada es la primera indicación de que el ADN se ha degradado. Si este es el caso, ten cuidado de evitar la contaminación con ADNasas o nucleasas. Sobrecargar los pocillos de la muestra con ADN puede también resultar en una calle aparentemente manchada, caso en el cual la cantidad de ADN debe ser reducida. Controla que las condiciones de la electroforesis no excedan los ~20V/cm y que el gel no se sobrecaliente (más de 30 grados Celsius). También toma en cuenta que se use suficiente amortiguador de electroforesis para cubrir el gel.

Migración anormal de bandas

Verifica que se use el voltaje correcto y que no exceda los 20V/cm. También controla que la temperatura del amortiguador durante la electroforesis permanezca por debajo de los 30 grados Celsius y que el volumen sea el adecuado para sumergir el gel. Por sobre todo, controla que la integridad del ADN esté intacta y que no esté degradado.

Resolución pobre de banda

Asegúrate de que la cantidad de muestra aplicada no exceda el volumen del pocillo. También controla que la masa o concentración correcta de muestra que está siendo corrida no sobrepase el pocillo.

Duración anormal de la corrida

Si el gel fue corrido demasiado rápido, esto podría deberse a que los amortiguadores están muy diluidos, por lo tanto debes controlar que la concentración sea la correcta, de otra forma prepara los amortiguadores nuevamente o concéntralos. Asegúrate de que el voltaje no sea excesivo. Si la corrida está procediendo muy lentamente, verifica que el amortiguador no esté demasiado concentrado, o que el voltaje no esté muy bajo.

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