Procedimiento para realizar electroforesis en gel

Escrito por palmer owyoung | Traducido por sofía bottinelli
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Procedimiento para realizar electroforesis en gel
La electroforesis en gel es un técnica esencial para el análisis de segmentos de ADN. (Comstock/Comstock/Getty Images)

La electroforesis en gel es una técnica esencial en biología molecular para el análisis de segmentos de ADN no superiores a las 25 kilobases ni inferiores a las 500 bases. Es usado por biólogos moleculares entrenados para determinar el tamaño de un fragmento de ADN para experimentos posteriores como clonado de genes. Debido a la naturaleza altamente técnica y biológica, se asume que los usuarios de este procedimiento han sido entrenados en biología avanzada y protocolos de seguridad en el laboratorio.

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Prepara el gel de agarosa y otros materiales necesarios

El tamaño del segmento de ADN a ser separado es, generalmente, conocido de antemano. Esto determinará cuánta agarosa debe ser agregada (calculada en porcentaje) a una solución tampón de electroforesis, conocida como solución tampón de corrida TAE o TBE. Por ejemplo, un fragmento de ADN de 25 kilobases puede ser separado usando un gel de agarosa 0,5% que se prepara disolviendo 50 gramos de polvo de agarosa en 100 mililitros de TAE en un frasco o botella resistente al calor. Esto se calienta gentilmente en un microondas hasta que el polvo se disuelva. No debe hervir.

Monta el gel

La solución de gel de agarosa se mezcla con 0,5 microgramos por mililitro de bromuro de etidio, un compuesto que se intercala en el ADN y permite que los fragmentos se vean en el gel. La solución se vierte en un molde para gel que puede tener los extremos abiertos, los cuales deben sellarse con una cinta adhesiva o clips de ajuste para prevenir que la solución se escape. Un peine de gel es una herramienta utilizada para insertar pocillos para las muestras en las calles del gel. Uno o más de estos pueden colocarse en el gel para crear estos pocillos para muestras. Se deja enfriar la solución hasta que solidifique, lo que puede variar entre unos pocos minutos y varias horas, con un alto porcentaje de geles (aquellos menos diluidos) que enfrían más rápido. Un truco común es poner el gel en el refrigerador y luego permitirle alcanzar la temperatura ambiente antes de usarlo. Una vez preparado, el gel se usa lo más pronto posible o se envuelve en film transparente para evitar que se seque.

Cargando el gel

Una vez listo, el gel es preparado removiendo la cinta o clips de los extremos abiertos que es esencial para permitir el flujo de corriente eléctrica. El gel es removido gentilmente y toda la bandeja es sumergida dentro de la cuba electroforética, conteniendo suficiente solución tampón de electroforesis para cubrir la superficie completa del gel, prevenir que el gel se seque y que cortocircuitos interfieran. Las muestras de ADN son diluidas con una solución tampón coloreada de carga que también ancla el ADN al pocillo. Estas se preparan en un volumen tan pequeño como sea posible para satisfacer el volumen permitido por los pocillos creados en el gel. Luego, las muestras se cargan cuidadosamente en cada pocillo para asegurar que no ocurra contaminación cruzada de las muestras. También se incluye un marcador apropiado en uno de los pocillos para orientar al usuario en el tamaño de los fragmentos de ADN.

Corriendo el gel

El aparato de electroforesis es preparado verificando que los cables estén orientados en la dirección correcta de la cuba, para que las muestras corran del extremo negativo (cátodo) al positivo (ánodo) del gel. El voltaje también se establece en el nivel que se utiliza rutinariamente para ese aparato, por ejemplo, 10 voltios por centímetro de gel. Una vez que la tapa se coloca sobre la cuba, el aparato se prende y se permite que la electroforesis proceda un tiempo determinado. Este debe ser lo suficiente para permitir la separación de los fragmentos pero no demasiado para evitar que se caigan por el otro lado del gel y se pierdan en la cuba electroforética. Después de la corrida, el gel se observa en un transiluminador ultravioleta (UV) y las bandas se observarán como líneas fluorescentes brillantes, ya que el bromuro de etidio se intercala al ADN y fluoresce bajo luz UV.

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