Protocolos para ELISA

Escrito por sam lupica | Traducido por mary gomez
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Protocolos para ELISA
Un ELISA es un protocolo rápido y específico para detectar antígenos. (Comstock/Comstock/Getty Images)

Un ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA, por sus siglas en inglés) es un ensayo inmunológico sensible para detectar la presencia de antígenos en muestras biológicas. El ELISA utiliza anticuerpos específicos unidos a una enzima que es detectable mediante el uso de absorción pasiva de la luz. Hay dos tipos comunes de ELISA: el ELISA Directo y el ELISA Sandwich.

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Principios básicos de un ELISA

Un ELISA utiliza antígenos que son absorbidos a los pozos de placas de microtitulación de plástico, los cuales luego se bloquean utilizando un agente para cubrir cualquier superficie restante en el pozo. El probador coloca un anticuerpo primario para adherirse específicamente al antígeno y luego añade un anticuerpo secundario, combinado con una enzima reactiva, para enlazarse con el anticuerpo primario. El probador luego agrega un sustrato que cambia de color para visualizar la concentración del antígeno. El color del sustrato aumenta junto con la concentración del antígeno.

Reactivos para ELISA

Los protocolos descritos en "Métodos de Biología Molecular" requieren los siguientes reactivos para cualquier tipo de ELISA: tampón de revestimiento de bicarbonato; PBS que contenga albúmina de suero bovino y Tween 20; tampón de fosfato; tampón de citrato, solución de parada; solución de lavado PBS y peróxido de hidrógeno. Los protocolos describen adicionalmente composiciones específicas y porcentajes para cada reactivo.

ELISA Directo

Añade tampón carbonato a cada pozo de una placa de microtitulación seguido por antígeno diluido en un tampón de revestimiento de bicarbonato. Incuba a temperatura ambiente durante dos horas o durante la noche. Lava la placa y deja secar a temperatura ambiente. Añade rábano picante conjugado con peroxidasa a cada pozo, diluido a una concentración apropiada, y permite que se incube a temperatura ambiente durante dos horas adicionales. Añade el amortiguador de bloqueo y lava cada pozo con solución de lavado. Añade tampón de citrato a cada pozo y permite que se desarrolle el color. Después de 10 minutos, detén la reacción con tampón de parada. Mide la absorbencia utilizando un espectrofotómetro.

ELISA sandwich

Basándose en el trabajo de Munro y Lasley (1988), el ELISA Sandwich utiliza una liga peroxidasa de rábano picante, antisuero y normas comerciales en una placa de microtitulación de 96 pozos. Los pozos de la placa están recubiertos con antisuero diluido en tampón de revestimiento de bicarbonato. Sella las placas con cuidado e incuba durante 12 horas a 4 grados centígrados. Diluye el conjugado de enzima en un tampón de fosfato. Elimina el exceso de anticuerpo con solución de lavado y deja secar a temperatura ambiente. Dispensa el tampón de fosfato en cada pozo seguido de solución de conjugado que contiene las normas o muestras. Cubre las placas durante dos horas. Lava las placas y deja secar a temperatura ambiente. Añade tampón de citrato a los pozos y deja que se desarrolle el color. Después de 60 minutos, detén la reacción con una solución de parada. Mide la absorbencia con el espectrofotómetro.

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