Técnica HPLC

Escrito por stephanie chandler | Traducido por mary gomez
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Técnica HPLC
La HPLC es la técnica preferida para separar, identificar y cuantificar moléculas de mezclas complejas. (molecule image by Vladislav Gajic from Fotolia.com)

HPLC son las siglas en ingles de cromatografía líquida de alto rendimiento, un procedimiento de análisis cualitativo y cuantitativo estándar utilizado en los laboratorios. La HPLC es fiable y repetible, lo que la convierte en la técnica preferida para separar, identificar y cuantificar las moléculas de mezclas complejas tanto de componentes químicos como de elementos biológicos.

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Cuatro componentes

La técnica HPLC contiene cuatro componentes principales. En primer lugar, es importante el sistema de entrega de disolvente (fase móvil) que lleva las muestras a través de la columna, ya que la polaridad afecta la capacidad que tiene el sistema para separar las moléculas. La columna de cromatografía es generalmente una columna de vidrio vertical que se llena con un adsorbente. En segundo lugar, el adsorbente (también conocido como fase estacionaria, ya que no se mueve) es comúnmente un gel de sílice o alúmina. En tercer lugar, el sistema de introducción de la muestra se compone de una especie de puerto de inyección para introducir la muestra que se va analizar en el sistema de entrega del disolvente. El cuarto componente es el detector.

Detectores

El tipo de detector a utilizar depende del tipo de muestra que los técnicos estén analizando y lo que las moléculas estén tratando de aislar. Entre los criterios utilizados por el técnico a la hora de elegir un detector se encuentra la selectividad, la relación señal-ruido, límite de detección, rango lineal, constante de tiempo, arrastre y volumen celular. Entre los detectores más utilizados se encuentran los detectores visibles ultravioletas, espectrómetros de masas, índices de refracción, detectores fluorescentes o dispositivos de dispersión de luz evaporada.

Procedimiento

Gira el detector, las bombas (que se utilizan para aumentar la presión para mover la fase móvil a través de la fase estacionaria), y la computadora que grabará e imprimirá el cromatograma. Elije los programas adecuados para recolectar los datos deseados. Inyecta la muestra en el puerto de inyección. Vigila la presión. Cada tipo de columna posee una presión máxima; no excedas este valor o no ocurrirá la separación. Imprime el cromatograma y analiza los resultados. Al final de cada procedimiento, es importante limpiar el puerto de inyección para evitar la acumulación que pueda bloquearlo.

Tipos

La cromatografía de interacción hidrófila utiliza una fase unida estacionaria polar y una no polar, una fase móvil miscible de agua para separar moléculas basadas en polaridad. Esta técnica tiene la capacidad de separar muestras ácidas, básicas y neutras en un cromatograma clave.

La cromatografía de fase normal utiliza una fase estacionaria polar y una fase no polar, una fase móvil no acuosa para separar isómeros estructurales (moléculas con la misma fórmula molecular que tienen los átomos unidos entre sí de distintas maneras).

La cromatografía en fase reversa es la más ampliamente utilizada. Utiliza una fase estacionaria no polar y una acuosa como una fase móvil polar. Este método es utilizado comúnmente por las compañías farmacéuticas para calificar las drogas antes de su comercialización.

La cromatografía de exclusión por tamaño separa las moléculas en función a su tamaño y también puede determinar la estructura de las proteínas.

La cromatografía de intercambio iónico se basa en la atracción entre los iones del soluto y los sitios cargados unidos en la fase estacionaria.

Usos

La HPLC es útil en distintas aplicaciones. Se puede utilizar para analizar los materiales farmacéuticos, lo que es útil en la investigación de nuevos fármacos, así como para purificar los ya existentes. También se utiliza para analizar fluidos biológicos, plaguicidas, explosivos y otros materiales. Aunque es una técnica muy utilizada para la investigación biomédica, bioquímica y farmacéutica, también se utiliza en los cosméticos, alimentos, medio ambiente y las industrias de la energía.

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