Tipos de columnas HPLC

Escrito por hannah lane | Traducido por martin santiago
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Tipos de columnas HPLC
Las columnas de HPLC difieren en el tipo de fase estacionaria que utilizan. (blue particles image by Christopher Ursitti from Fotolia.com)

La cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) es un tipo de cromatografía en columna diseñada para separar y clasificar los componentes de una muestra sobre la base de sus interacciones con una columna específica. HPLC es distinta, ya que utiliza un entorno más presurizado para propulsar las muestras líquidas a través de la densa columna de manera más eficiente. Tres tipos de columnas de HPLC están en uso común hoy en día, pero difieren en la naturaleza de la capa de material que recubre la columna e interactúa con la muestra.

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Columna de intercambio iónico

Los experimentadores utilizan cromatografía de intercambio iónico al separar muestras ionizables, o muestras que se puede cargar. La fase estacionaria, que es el material sólido que recubre la columna e interactúa con la muestra, posee una carga opuesta a la de la muestra de interés, de manera que la muestra será atraída a las paredes de la columna. Esta atracción ralentiza el tiempo de elución e la muestra, o el tiempo que se necesita para pasar todo la columna en la fase móvil. Mientras más cargadas estén las partículas de la muestra, más atraídas estarán por la fase estacionaria, lo que resulta en un tiempo de elución más lento. El tiempo de elución representan la intensidad de la carga de las partículas, y por lo tanto es el medio principal de clasificación de los distintos compuestos dentro de la muestra.

Columna de adsorción

Como su nombre lo indica, la cromatografía de adsorción funciona a través de una fase estacionaria adsorbente. La adsorción, que no debe confundirse con la absorción, implica la unión temporal de las partículas de la muestra a la fase estacionaria de la columna. El grado en el que una partícula de la muestra puede adsorberse a la fase estacionaria está determinada por la polaridad relativa, o carga, que la partícula puede poseer en un momento dado. Esto varía de la cromatografía de intercambio iónico en que las partículas no se cargan de manera explícita, sino que a veces son ligeramente positivas o negativas a medida que la partícula gira y vibra. Mientras la partícula se mueve hacia abajo en la columna, se adsorbe y de-adsorbe en diversos grados en función del nivel de polaridad que posee. Los tiempos de elución proporcionan una medida del nivel de polaridad de las partículas de la muestra.

Columna de exclusión por tamaño

La cromatografía de exclusión por tamaño utiliza una técnica de separación diferente a la de intercambio iónico o de adsorción. Este tipo de columna es menos común que las otras dos, pero es útil cuando se separan biomoléculas grandes como proteínas o hidratos de carbono. La fase estacionaria se compone de partículas no cargadas, que son de tamaño controlado y porosas. Cuando la muestra se dispara a través de la columna, las partículas de tamaño más pequeño son absorbidos temporalmente en el recubrimiento de la columna, mientras que las partículas más grandes pasan directamente a través de él y se eluyen primero. La fase estacionaria está diseñada de manera que cuanto más pequeña sea la partícula, más profundamente penetra en el recubrimiento de la columna, lo que significa que a las partículas más pequeñas les tomará la mayor cantidad de tiempo para volver a la superficie y eluir. Las muestras se pueden clasificar de acuerdo con el tiempo de elución, lo que se corresponde directamente con tamaño de partícula.

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