¿Cuáles son las funciones del gel de agarosa en la electroforesis?

Escrito por lizzie brooks | Traducido por maría florencia lavorato
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¿Cuáles son las funciones del gel de agarosa en la electroforesis?
La electroforesis se ejecuta en gel de agarosa, entre otros geles. (blue pipette tips image by BigDog from Fotolia.com)

La electroforesis en gel de agarosa es una técnica de laboratorio por el cual las proteínas se separan la una de la otra sobre la base de su tamaño. Una muestra de las proteínas mezcladas, con frecuencia segmentos de ADN o moléculas relacionadas, se colocan en un extremo de una hoja de gel de agarosa. La electricidad se aplica entonces al gel y los ácidos nucleicos cargados negativamente en las proteínas son atraídos a la carga positiva en el otro extremo del gel con proteínas más pequeñas moviéndose más lejos que las más grandes, formando una serie de bandas de cada tamaño de proteína.

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Sustrato

En gel de agarosa es un polisacárido que forma una matriz similar a la gelatina. El gel proporciona un sustrato sobre el que se puede producir la separación del ADN. Los fragmentos de ADN más grandes toman más tiempo para migrar a través de la malla de la matriz. Este fenómeno facilita la separación de las moléculas por tamaño.

Resolución

El ADN que varía en tamaño desde unos pocos pares de bases hasta varios millones de pares de bases puede separarse utilizando electroforesis en gel de agarosa. La concentración de agarosa usada para hacer el gel determina la claridad de la resolución de las partículas de proteína. Las moléculas de ADN más pequeñas se resuelven más claramente cuando se utiliza una concentración más alta de gel de agarosa al ejecutar el ejemplo.

Absorción tamponada

Con el fin de aplicar una carga eléctrica a la muestra de ADN, el gel de agarosa debe estar saturado con una solución tampón que contiene sal. Dos soluciones tampón populares son TAE (Tris-acetato-EDTA) y TBE (Tris-borato-EDTA). Los tampones deben ser añadidos a una concentración precisa; un tampón excesivamente diluido inhibe el movimiento de las partículas de proteína y un tampón excesivamente concentrado se puede sobrecalentar cuando se aplica energía eléctrica y el exceso de calor puede fundir el gel o dañar las proteínas.

Colorante de contraste de fondo

Los colorantes fluorescentes tales como el bromuro de etidio se pueden añadir a una muestra con el fin de visualizar las proteínas de ADN separadas cuando la electroforesis es completa. Este colorante se adhiere a los espacios entre los ácidos nucleicos de ADN. El gel de agarosa proporciona un contraste visual para los colorantes de modo que la ubicación de cada banda de proteína puede discernirse claramente.

Referencia

Una muestra de referencia de proteínas de tamaño conocido llamado "escalera" frecuentemente se ejecuta en paralelo a la muestra en cuestión. Dado que todas las proteínas de la misma forma y tamaño se mueven a la misma velocidad en la misma concentración de gel de agarosa, la posición de las proteínas de escalera en relación con la muestra se puede usar para determinar el tamaño de las proteínas en cuestión.

Captura de proteínas

Después de que las proteínas se han separado, el gel de agarosa las mantiene en su lugar cuando la energía eléctrica se apaga. Cada banda de proteínas, entonces, se puede quitar de forma individual a partir del gel y se procesa para más pruebas o experimentación.

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